Лаборатория патологии и фармакологии гемостаза

Заведующий лабораторией — Белозерская Галина Геннадьевна, доктор медицинских наук.

Лаборатория патологии и фармакологии гемостаза была основана в 1985 г. С 1985 по 2014 гг. обязанности заведующего исполнял д.м.н., профессор В.А. Макаров - Лауреат Государственной Премии за разработку местного гемостатического средства для использования в Советской Армии. С 2014 г. по настоящее время обязанности заведующего исполняет д.м.н. Г.Г. Белозерская.

За время работы лаборатории в направлении исследований новых гемостатических средств местного и системного действия сотрудниками были разработаны различные методы оценки гемостатической активности новых лекарственных средств на экспериментальной модели, которые утверждены Фармкомитетом МЗ РФ для доклинической оценки гемостатического действия потенциальных лекарственных средств и описаны в разделе «Методические рекомендации по изучению лекарственных средств, влияющих на гемостаз» в «Руководстве по проведению доклинических исследований лекарственных средств» часть первая.-М.: Гриф и К, 2012, стр. 453—479, изданного под эгидой Минздрава России.

Основная тематика работы коллектива лаборатории патологии и фармакологии гемостаза - создание новых средств и методов диагностики и лечения патологии гемостаза. Исследования ведутся по разработке новых гемостатических и противотромботических средств.

В настоящее время в лаборатории работают 2 доктора наук: д.м.н. Г.Г. Белозерская (заведующий лабораторией, разработка гемостатических средств), ведущий научный сотрудник д.б.н. Н.Н. Дрозд (анализ гемосовместимости); 2 кандидата наук: старший научный сотрудник к.м.н., биохимик Ю.С. Логвинова (разработка гемостатических средств), старший научный сотрудник к.б.н. О.Е. Неведрова (разработка гемостатических средств), ведущий специалист, мл.н.с. В.А. Кабак; биохимик А.В.Калелова, специалист Л.В.Баранникова, лаборант-исследователь Г.С Денисов; лаборант-исследователь А.А.Росса; лаборант Е.А. Кузнецова.

Сотрудники лаборатории принимали участие в разработке композиционного гемостатического материала «Колетекс-Гем», позволяющего останавливать капиллярно-паренхиматозное кровотечение в условиях скорой помощи, ожоговых центрах, при пластических операциях. Также они принимали участие в разработке коллагено-тромбоцитарной гемостатической губки «Тромбокол», которая применяется при любом виде хирургического вмешательства, разработке гемостатической повязки «Гемотекс», получившей широкое применение в условиях скорой помощи и хирургической практике. Колетекс-Гем, Тромбокол, Гемотекс, Гемокомпакт разрешены МЗ и СР РФ для клинического применения и выпускаются на производствах «Белкозин», ООО «Альтекс+», ООО «Текстильпрогресс», НПО «ИнтерВита».

Сотрудники лаборатории совместно с НИИ Текстильных материалов принимали участие в создании нового гемостатического средства местного действия «β-гемостопан» на основе окисленной целлюлозы (диальдегидцеллюлозы). Комплект гемостатических средств «β-гемостопан» (5 изделий: аппликация, микроволокно, корпия, бандаж, пластырь) приказом Росздравнадзора от 10 мая 2016 г. № 3985 допущен к обращению на территории Российской Федерации.

Сотрудники лаборатории принимали участие в создании нового препарата - рекомбинантного фактора VIIa.

Совместно с лабораторией химии белка ГосНИИ Генетики исследовали производные пептидов, содержащие вторичные амиды лизина. Пептиды For-Ala-Phe-Lys-Mf۰НСl и For-Ala-Phe-Lys-Pip۰НСl по сравнению с контролем заметно замедляли XIIa-зависимый эуглобулиновый лизис и удлиняли время растворения сгустка. Сравнительный анализ гемостатического эффекта исследуемых пептидов с известными ингибиторами фибринолиза (ε-аминокапроновая и транексамовая кислота) при экспериментальной геморрагии показал превосходство пептидов над ε-аминокапроновой и транексамовой кислотами.

В лаборатории проводилось исследование по изучению влияния физико-химических свойств веществ в различных лекарственных формах (порошка, губки и трикотажных материалов) на время остановки кровотечения. Была выявлена четкая зависимость активности данных веществ от показателей адсорбирующего эффекта и параметров влагопоглощения, что имеет большое значение для дальнейших разработок новых гемостатических средств местного действия. Совместно с Алтайским филиалом ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России проводятся исследования по определению изменений гемостатических реакций как in vitro, так и in vivo. Исследование in vitro проводились с использованием предложенной нами новой Тест-системы (Евразийский патент на изобретение № 040347 от 23.04.2022; Патент РФ № 2701195 от 25.09.2019; Патент РФ № 2695075 от 19.07.2019). Исследования in vivo проводились по методике, разработанной в лаборатории патологии и фармакологии гемостаза ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России и утвержденной Фармкомитетом Минздрава России для доклинической оценки гемостатического действия потенциальных лекарственных средств и описанной в разделе «Методические рекомендации по изучению лекарственных средств, влияющих на гемостаз» в «Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств» (часть первая, Москва, Гриф и К, 2012, стр. 453-479).

Совместно с ООО Фирма «Технология-Стандарт» (г. Барнаул), проводятся исследования отечественного инновационного гемостатического лекарственного средства системного действия на основе производного фибриногена для остановки кровотечений, в том числе у больных с острой кровопотерей и получающих антитромботические препараты (патент Российской Федерации № 2522237 от 10.07.2014).

В ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России совместно с ФГБУ науки Институт проблем химико-энергетических технологий СО РАН (г. Бийск) и ФГБОУ ВО «Алтайский государственный технический университет им. И.И. Ползунова» (г. Барнаул) создано раневое покрытие на основе целлюлозы, полученной с помощью биотехнологий, обладающее гемостатическим действием (патент Российской Федерации № 2624242 от 03.07.2017).

В ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России разработаны технологии получения и исследованы на гемостатическую активность образцы губок и порошков на основе хитозана и альгината натрия (патенты Российской Федерации № 2618896 от 11.05.2017, № 2628809 от 22.08.2017, № 2652270 от 25.04.2018, № 2660582 от 06.07.2018).

В ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России совместно с ФГБУ науки Иркутский институт химии им. А.Е. Фаворского СО РАН (г. Иркутск) разработаны гемостатические средства локального действия на основе солей полиакриловой кислоты (патенты Российской Федерации № 2314815 от 20.01.2008, № 2428989 от 20.09.2011, № 2428990 от 20.09.2011, № 2426546 от 20.08.2011, № 2424813 от 27.07.2011, № 24224814 от 27.07.2011, № 2607519 от 10.01. 2017, № 2585366 от 27.05.2016).

Патент № 2607519 от 10.01.2017 включен в топ-100 лучших российских изобретений 2017 г.

ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России совместно с ТИБОХ ДВО РАН ведется разработка гемостатических покрытий на основе сульфатированных полисахаридов.

В ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России разработаны и исследованы гемостатические композиции на основе металлов в форме губки и пленки (Патент РФ № 2627855 от 14.08.2017; Патент РФ № 2639379 от 21.12.2017)

В ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России совместно с ЗАО «Робелл Технолоджи СПб» (г. Санкт-Петербург) ведутся разработки новых технологий получения гемостатических препаратов локального действия на основе поливинилпирролидона Полидона-А1 (патент Российской Федерации № 2705812 от 12.11.2019).

В ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России совместно с Томским политехническим университетом (г. Томск) проводится работа по созданию гемостатических покрытий на основе оксидов металлов, полученных с помощью нанотехнологий (патент Российской Федерации № 2739490 от 24.12.2020).

Проводимые нами исследования могут найти широкое применение не только в силовых ведомствах (МО, МЧС, МВД), но и в условиях скорой медицинской помощи, хирургических и терапевтических отделениях госпиталей и клиник, будут востребованы в аптечной сети для применения в быту и ветеринарии.

Методы комплексной оценки исследования гемостатической активности новых соединений:

в опытах in vitro:

• определение гемостатической активности вещества системного действия в условиях острого опыта на животных:
• оценка гемостатической активности соединения при его внутривенном введении интактным кроликам;
• оценка гемостатической активности соединения при его внутривенном введении кроликам на фоне экспериментальной кровопотерей 7-10% от ОЦК;
• оценка гемостатической активности соединений при его внутривенном введении кроликам на фоне экспериментальной кровопотерей 10-30% от ОЦК;
• определение гемостатической активности веществ местного действия
• оценка гемостатической активности в условиях коагулопатий, вызванных гепарином или варфарином;

в опытах ex vivo:

• определение агрегационной активности тромбоцитов;
• определение активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ);
• определение протромбинового времени (ПВ);
• определение тромбинового времени (ТВ);
• определение концентрации фибриногена;
• определение концентрации D-димера в плазме крови;

в опытах in vivo:

• определение времени смачивания губок;
• определение водопоглощения губок;
• определение общей пористости и толщины губки (Объём сквозных и тупиковых пор);
• определение количества тромбоцитов;
• определение концентрации фибриногена;
• интегральная оценка системы гемостаза –тромбоэластометрия;
• интегральная оценка системы гемостаза – тест генерации тромбина.

Исследования по определению антикоагулянтной и антитромботической активности проводятся ведущим научным сотрудником д.б.н. Дрозд Н. Н.

С целью выявления соединений с антикоагулянтной и антитромботической активностями исследуем связь структура—активность, механизмы действия и фармакологические свойства новых ингибиторов факторов свертывания крови, новых активаторов плазменных ингибиторов сериновых протеиназ свертывающей системы крови и новых ингибиторов агрегации тромбоцитов. На основе наших рекомендаций соавторы—химики имеют возможность направленно получать активные соединения. Разработан алгоритм комплексной оценки антикоагулянтной и антитромботиченской активностей соединений в системах in vitro и ex vivo.

Подходы и методы исследования:
в опытах in vitro:

• определение ингибиторных концентраций соединений в стандартных коагулологических тестах время свертывания крови, активированное время рекальцификации крови, время рекальцификации плазмы, активированное частичное тромбопластиновое время, протромбиновое время, тромбиновое время, РеаКлот-Гепарин (аналог Heptest), экариновое (эхитоксовое) и рептилазное (батроксобиновое) время с плазмой человека и экспериментальных животных;
• определение ингибиторных концентраций соединений в тестах с хромогенными субстратами для факторов свертывания (в том числе генерация тромбина);
• определение активности/концентрации первичных физиологических антикоагулянтов;
• определение антитромбиновой и анти-фактор Ха активностей соединений с применением Международных стандартов в соответствии с рекомендациями USP, EP, Международного комитета по стандартам ВОЗ;
• оценка связи между структурой и антикоагулянтной активностью соединений с помощью регрессионного, корреляционного и дисперсионного анализов;
• анализ антидотной активности соединений при нейтрализации активности антикоагулянтов;
• анализ комплексообразования с поликатионами (для полианионов) с помощью биоспецифичного электрофореза или турбидиметрического титрования;
• анализ нейтрализации антидотами-поликатионами антикоагулянтной активности соединений-полианионов с использованием коагулологических и амидолитических тестов;
• оценка влияния соединений на агрегацию тромбоцитов человека и экспериментальных животных, индуцированную аденозин 5´-дифосфатом, коллагеном, ристомицином;
• определение числа тромбоцитов;
• оценка адгезии тромбоцитов;
• оценка гемолиза эритроцитов;

в опытах in vivo:

• определение фармакодинамических параметров соединений при внутривенном, подкожном или пероральном введениях экспериментальным животным (кролики, морские свинки) в сравнении с используемыми в клинической практике антикоагулянтами или антиагрегантами;
• оценка антитромботической активности соединений на модели экспериментального венозного тромбоза у морских свинок по S. Wessler;
• оценка геморрагической активности соединений при введении экспериментальным животным.

Проведены сравнительные исследования специфической антикоагулянтной активности следующих соединений, полученных в лабораториях соавторов—химиков:

• полусинтетические полисахариды животного происхождения;
• химически модифицированные хитозаны (Московский государственный текстильный университет им. А.Н. Косыгина и Центр «Биоинженерия» РАН);
• производные хитозана (Институт органического синтеза им. И.Я. ПостовскогоУрО РАН, Екатеринбург);
• кватернизированные хитозаны (Центр «Биоинженерия» РАН);
• нативные и полусинтетические полисахариды растительного происхождения;
• фукоиданы из бурых морских водорослей Охотского моря Fucusevanescens, Laminariacichorioides, Laminariajaponica, Undariapinnatifida, Laminariagurjanovae, CostariaCostata (Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН, Владивосток);
• ферментативно расщепленные фукоиданы из водоросли Laminariasaccharina; сульфатированная альгиновая кислота из бурой водоросли Macrocystispurifera (Центр «Биоинженерия» РАН);
• хроматографически фракционированный фукоидан из водоросли Laminariasaccharina (Институт органической химии им. Н. Д. Зелинского РАН);
• сульфатированные галактоманнаны из семян CyamopsisTetragonoloba (L.) Taub.,Galegaorientalis Lam, Styphnolobiumjaponicum, Locust Bean (Институт биохимииим. А. Н. Баха РАН);
• химически модифицированная целлюлоза хлопка, пихты, сульфаты крахмала, инулина, пектина и коньюгаты сульфатов целлюлозы с терпенофенолами (Институт химии Коми научного центра УрО РАН, Сыктывкар);
• сульфатированная целлюлоза из древесины пихты, осины, соломы пшеницы, сульфатированные ксиланы, сульфатированные арабиногалактаны и цианидины из коры березы, ели, сосны, лиственницы, кедра (Института химии и химической технологии СО РАН и Сибирский федеральный университет, Красноярск);
• сульфаты пектина из травянистых растений: бадана толстолистного (Bergeniacrassifolia (L.)Fritsch.), сабельника болотного (Comarumpalustre L.), ряски малой (Lemnaminor L.), рдеста плавающего (Potamogetonnatans), пижмы обыкновенной (Tanacetumvulgare L.) (Институт физиологии Коми НЦ УрО РАН, Сыктывкар);
• наночастицы на основе хитозана и галактоманнана, нагруженные низкомолекулярным или нефракционированным гепаринами, полиэлектролитные комплексы сульфатов хитозана, наноструктуры на основе сульфата альгиновой кислоты (Центр «Биоинженерия» РАН и Институт биохимии им. А. Н. Баха); нанокристаллы хитина (Институт химии Коми НЦ УрО РАН, Сыктывкар);
• синтетические фукозилированные олигосахариды (Института органической химии им. Н. Д. Зелинского РАН);
• синтетические производные пептидов ZАla-Ala-Arg-Рip* TFA; Z-Ala-Ala-Arg-Mf*HBr; Ac-Trp-Arg-Mf*HCl; Fta-Gly-Arg-Pip* TFA; Ac-Trp-Arg-Pip (ГосНИИгенетика).

Патентная защищенность (15 патентов) является предпосылкой для создания новых «атромбогенных» модификаций поверхностей полимерных материалов, используемых при изготовлении емкостей для хранения крови/плазмы, сосудистых катетеров, протезов кровеносных сосудов, ловушек для тромбов, искусственных клапанов сердца, систем искусственного и вспомогательного кровообращения и т. д.

Исследованные образцы полисахаридов с наибольшей антитромбиновой активностью можно использовать в качестве самостоятельного покрытия поверхности полимерных материалов; субстанции с меньшей антитромбиновой активностью можно коньюгировать с нефракционированным или низкомолекулярным гепаринами (увеличивая их стабильность и активность), традиционно используемыми для достижения «атромбогенности» поверхности некоторых полимерных материалов.

Кватернизированный хитозан, так же как и сульфат протамина, нейтрализует полностью антитромбиновую активность нефракционированного гепарина и частично нейтрализует аХа активность низкомолекулярного гепарина (эноксапарин) при внутривенном введении морским свинкам.

Методологическая база позволяет проводить некоторые исследования, необходимые для анализа гемосовместимости растворимых и нерастворимых в воде субстанций и материалов. Так, коньюгаты декстрана с 4-метил-2,5-диизоборнилфенолом и нанокристаллы хитина могут представлять интерес в качестве носителей для доставки лекарственных средств.

Разработан метод выбора антидота для нейтрализации антикоагулянтной активности сульфатированных полисахаридов на основе фиксирования комплексов между антикоагулянтами и поликатионами (Патент РФ 2370271).

На основе полученных патентов на изобретения (патент РФ 2221578 и патент РФ 2195673) созданы и производятся наборы реактивов для определения активности антитромбина в плазме и для определения ингибирования гепаринами фибриногенсвертывающей и амидолитической активности фактора Ха.

Публикации за последние 5 лет

1. Drozd NN, Shagdarova BT, Il′ina AV, Varlamov VP. Effects of Chitosan Derivative N-[(2-Hydroxy-3-Trimethylammonium)Propyl]Chloride on Anticoagulant Activity of Guinea Pig Plasma // Bull ExpBiol Med, 2017, V 163, N 3, p. 340—343, doi: 10.1007/s10517—017—3799—6.

2. Drozd NN, Logvinova YS, Torlopov MA, Udoratina EV. Effect of sulfation and molecular weight on anticoagulant activity of dextran // Bull ExpBiol Med. 2017. V 162. №4. P 462—465; DOI: 10.1007/s10517—017—3640—2

3. Drozd NN, Logvinova YS, Torlopov MA, Udoratina EV. Effect of Sulfation and Molecular Weight on Anticoagulant Activity of Dextran // Bull ExpBiol Med, 2017, V 162, N 4, p. 462—465, doi: 10.1007/s10517—017—3640—2.

4. Drozd NN, Kuznetsova SA, Kalinina TB, Vasilieva NY. Dose Dependence of the Anticoagulant Effect of Intravenously Administered Cellulose Sulfate // Bull ExpBiol Med, 2016, V 160, N 6, p. 767—770, doi: 10.1007/s10517—016—3305—6.

5. Shagdarova BT, Il′ina AV, Varlamov VP, Drozd NN, Logvinova YS. Neutralization of anticoagulant activity of heparin by N-[(2-hydroxy-3-trimethylammonoium)propyl]chloride derivatives of chitosan // ApplBiochMicrobiol, 2016, V 52, N 4, P. 445—451, doi: 10.1134/S0003683816040141

6. КузнецоваС.А., ДроздН.Н., СавчикЕ.Ю., МифтаховаН.Т., ВасильеваН.Ю., МакаровВ.А., КузнецовБ.Н. Антитромботическоесредствоизцеллюлозыпихтысибирской // ПатентРФ № 2571555, опубл. 20.12.2015

7. Дрозд Н.Н., Шагдарова БЦ, Ильина АВ, Варламов ВП. Нейтрализация кватернизированным производным хитозанаантикоагулянтной активности плазмы морских свинок // Гематология и трансфузиология, 2016, Т. 61, N S1(1), С. 114—115

8. Drozd NN, Savchik EY, Miftakhova NT, Kuznetsova SA, Vasilieva NY. Effects of subcutaneous microcrystalline cellulose sulfate extracted from wood of Siberian fir (abiessibiricaledeb) on the clotting of rabbit plasma // Pharm Chem J, 2015, V 49, N 3, P. 167—170. doi: 10.1007/s11094—015—1246—4

9. Кужим АА, Дрозд НН, Торлопов МА. Нейтрализация сульфатом протамина антикоагулянтной активности сульфатированной целлюлозы, выделенной из GossypiumHirstum L // Вопрбиол мед фарм химии, 2014, М 12, N 1, С. 34—38

10. Кужим АА, Дрозд НН, Торлопов МА, Макаров ВА. Нейтрализация сульфатом протамина антикоагулянтной активности сульфатов целлюлозы invitro // Гематология и трансфуз, 2014, Т 59, N S1, С. 48—49

11. Дрозд Н.Н., Калинина Т.С., Кузнецова С.А., Васильева Н.Ю., Кузнецов Б.Н., Макаров В.А. Средство с антитромботической активностью // Патент РФ № 2627435, опубл. 08.08.2017.

12. Дрозд Н.Н. Макаров В.А. Антикоагулянтная активность субстанций, нано- и микроструктур на основе производных хитозана // В книге: Хитозан, под ред. Скрябин КГ, Михайлов СН, Варламов ВП, Москва, 2013, С. 530—563.

13. Кужим АА, Дрозд НН, Торлопов МА, Ильина АВ. Связь между антикоагулянтной активностью сульфатированных растительных полисахаридов и размером области их преципитации с поликатионами при проведении биоспецифичного электрофореза // Эксп клин фарм. 2013, Т 76. 10, С 20—24

14. Savchk EY, Kalinina TB, Drozd NN, Makarov VA, Zav′yalova EG, Lapsheva EN, Mudrik NN, Babij AV, Pavlova GV, Golovin AV, Kopylov AM. Aptamer RA36 inhibits of human, rabbit, and rat plasma coagulation activated with thrombin or snake venom coagulases // Bull ExpBiol Med, 2013, V 156, N 1, p. 44—48, doi: 10.1007/s10517—013—2274—2.