Если попробовать ввести в Интернете словосочетание «жидкостная биопсия» поисковые системы предложат сотни тысяч, а то и миллионы страниц. Практически все будут апеллировать к тому, что это новейший метод диагностики. В основе которого лежит анализ следовых количеств ДНК опухолевых клеток.
О том, насколько жидкостную биопсию можно рассматривать как инновационный метод и в чем заключаются его плюсы и минусы, мы поговорили с заведующим отделом молекулярной генетики НМИЦ гематологии Минздрава России, д.б.н. Андреем Борисовичем Судариковым.
Андрей Борисович, в рамках научно –практической конференции «Лейкозы и лимфомы. Терапия и фундаментальные исследования. Актуальные вопросы лимфопролиферативных заболеваний» в своем докладе о возможностях и перспективах обнаружения свободной опухолевой ДНК в диагностике и лечении лимфом, вы подвергаете сомнению общепринятую точку зрения, что «жидкостная биопсия», это совершенно новый метод исследования?
- Давайте обратимся к истории. Впервые нуклеиновые кислоты в плазме крови с помощью методов классической биохимии были найдены в 1948 году французскими авторами. Mandel P. и Metais P. измеряли ДНК и РНК по рибозе и дезоксирибозе и показали, что в плазме крови у здоровых и у больных разными болезнями людей встречаются РНК и ДНК. Это было 75 лет назад. В дальнейшем появились статьи в которых использовали более чувствительные методы анализа ДНК и РНК. В частности, Leon S. с соавторами для определения ДНК применили радиоиммунный метод. В качестве аналита использовали сыворотку больного системной красной волчанкой, которая содержала антитела против ДНК. В ходе исследования было обнаружено, что количество этой циркулирующей ДНК при терапии у одних пациентов возрастает, у других падает, а у третьих - не меняется. Это было 46 лет назад. Именно опухолевая циркулирующая ДНК впервые была обнаружена 26 лет назад G. Sorenson с соавторами. Первое исследование на опухолевые маркеры, в данном случае на мутацию в гене KRAS с помощью алель-специфичной ПЦР проведено в 1994 году. Для подтверждения был задействован метод секвенирования. Этот алгоритм работает и по сей день.
А когда впервые стали смотреть циркулирующую опухолевую ДНК при лимфомах?
- 26 лет назад. N. Frickhofen с соавторами сделали вывод, что опухолевая ДНК может быть обнаружена и в сыворотке, и в плазме большинства пациентов с В-клеточными злокачественными новообразованиями.
Как попадает опухолевая ДНК в кровь? И можно ли измерить её концентрацию количественно?
-Свободные нуклеиновые кислоты попадают в кровь разными путями. Например, когда опухоль разлагается путем некроза или апоптоза, свободная ДНК и РНК попадают в кровь. Они могут активно туда секвестрироваться в составе субклеточных фрагментов (везикул) либо в виде протеиновых или мембранных комплексов и таким образом находится в кровотоке. Размер фрагментов зависит от активности нуклеаз, которые нарезают ДНК в хромосомах в доступных им местах. Чаще всего разрезание происходит между участками ДНК, «намотанными» на октомеры гистонов, и получаются фрагменты длиной 150-350 пар оснований. Для разных патологических состояний соотношение фрагментов разной длины может различаться. Если говорить про концентрацию нуклеиновых кислот, то это пикограммы на микролитры или нанограммы на миллилитры. Концентрация меняется в процессе терапии.
Что происходит со свободными нуклеиновыми кислотами в крови?
– Они деградируют и активно удаляются системами фагоцитоза и также секретируются почками. Таким образом, эти ДНК и РНК не стабильны.
Какие факторы влияют на количество и выявление опухолевой ДНК в крови?
- Прежде всего, влияет объем опухоли и скорость ее распада. Чем больше опухолевых клеток и выше скорость распада, тем больше опухолевой ДНК выйдет в кровь. Соответственно, чем ниже скорость деградации и выведения, тем меньше концентрация опухолевой ДНК. Но нужно помнить, что когда мы измеряем опухолевую ДНК на другой чаше весов всегда здоровая ДНК. Которая будет нам мешать.
Что это означает?
Дело в том, что здоровая циркулирующая ДНК в большом количестве высвобождается при воспалении. Также здоровая ДНК может с разной скоростью деградировать, накапливаться. И все это будет вносить неопределенность в тот сигнал, который мы хотим увидеть при помощи анализа циркулирующей опухолевой ДНК.
В каких случаях свободно циркулирующая опухолевая ДНК не будет обнаружена?
Когда нет опухолевого процесса. Нет опухоли, соответственно, нет ДНК. Однако опухолевые очаги могут быть свежими, активно пролиферирующими, и опухоль еще не начала распадаться. В этом случае выброс опухолевой ДНК практически невозможно зафиксировать. Сложности могут быть и при выделении ДНК из плазмы. Когда мы берем кровь, в ней содержится большое количество лейкоцитов, и если случайно взять лейкоциты, то они испортят всю картину. Там будет избыток здоровой ДНК. Поэтому обязательное условие – кровь необходимо центрифугировать. При этом могут осесть везикулы, в которых как раз и находятся свободно циркулирующие опухолевые ДНК, либо ДНК может «всплыть» в составе хиломикронов или липопротеиновых комплексов. Еще один момент, когда свободно циркулирующая опухолевая ДНК может быть не обнаружена. Например, когда имеется избыток здоровой (неопухолевой) циркулирующей ДНК, вызванный инфекционным процессом, воспалением и т.д.
Получается, обнаружить опухоль с использованием этого метода можно только в том случае, если все, что вы перечислили, не произошло?
Попробуем резюмировать. Исследуя свободно циркулирующую опухолевую ДНК, мы можем получить следующую информацию. Если свободноциркулирующая опухолевая ДНК не обнаружена, то метод не всегда может быть информативен. Отрицательный результат может получиться как по причине отсутствия опухоли, так и недостаточном её распаде, либо из-за присутствия большого количества здоровой циркулирующей ДНК. В случае отрицательного результата всегда необходимо наличие опухоли подтверждать независимыми методами. В случае лимфомы это ПЭТ КТ. А вот положительный результат свидетельствует о наличии опухоли, и в этом случае мы получаем возможность исследовать все многообразие опухолевых клонов. Потому что в плазме мы имеем естественную интегральную картину. По свободной циркулирующей опухолевой ДНК мы можем оценивать гетерогенность и эволюцию опухолевых клонов.
В НМИЦ Гематологии Минздрава России этот метод используется?
Пока только в исследовательских целях (не для рутинной диагностики). Это делается в лаборатории молекулярной гематологии. Буквально недавно в международном рецензируемом журнале Genes в специальном выпуске "Генетика болезней крови" опубликована статья ««Потеря гетерозиготности в циркулирующей ДНК опухоли и CD138+ клетках костного мозга при множественной миеломе». В ней рассказывается о результатах проспективного исследования, которое проводилось на базе нашего Центра. В исследование включено 38 пациентов в возрасте от 35 до 84 лет. Для молекулярно-генетического исследования ДНК выделяли из образцов различной локализации (плазма крови, CD138+ клетки костного мозга, клетки буккального эпителия) у всех больных. Автороми сделан вывод, что стратификация риска на основе молекулярных тестов, выполненных исключительно на образцах костного мозга, может быть недостаточной для всех пациентов с множественной миеломой, в том числе без плазмоцитом. В связи с генетической гетерогенностью (разнообразием) опухолевых клеток ММ из различных очагов становится очевидной высокая диагностическая ценность подходов жидкостной биопсии. И этот метод исследования свободно циркулирующей ДНК, который попадает в кровь из всех возможных локализаций опухоли, обладает возможностью разрешить конфликт, когда в разных частях организма находятся разные опухолевые метастазы, и мы не можем получить достоверную и адекватную информацию о свойствах опухоли, сделав биопсию только одного опухолевого узла.
Заниматься выделением свободно циркулирующей ДНК в плазме имеет смысл только при тех опухолях, которые не вовлекают костный мозг. Когда имеется поражение костного мозга, то более достоверно получается использовать традиционные методы диагностики?
Безусловно, все методы жидкостной биопсии разрабатываются на тот случай, когда невозможно подобраться к очагу и взять опухолевый субстрат. Это неинвазивная (не связанная с оперативным вмешательством) замена обыкновенному биопсийному исследованию, которое может быть либо затруднено, либо невозможно.
Чтобы вы порекомендовали коллегам, которые используют этот диагностический метод в рутинной практике?
Исследование свободно циркулирующей опухолевой ДНК обладает рядом ограничений, объясняющихся особенностями ее метаболизма, и, в частности, отрицательный результат должен быть перепроверен. Это неинвазивный метод, который при положительном результате позволяет спрогнозировать рецидив. Актуальной проблемой является стандартизация методов выделения свободно циркулирующей опухолевой ДНК и обеспечения надежности получения достоверных результатов. Исследование свободно циркулирующей опухолевой ДНК вместе с анализом отдельных очагов позволяет оценить мутационный статус опухоли в целом и возможную клональную гетерогенность. Я нисколько не критикую метод, а призываю коллег понимать ограничения этого метода. Всякий метод, в том числе и жидкостная биопсия, имеет свои возможности и ограничения. И если не принимать во внимание ограничения, то ничего толкового не получится.
